ÖZET

RET tirozin kinaz sinyal yolu, endokrin dirençli ER+ meme kanserinin gelişiminde rol oynar.Bununla birlikte, ER+ hücrelerinin RET sinyalizasyonunu nasıl aktive ettiği ve endokrin dirençli bir fenotipi nasıl başlattığı hakkında çok az şey biliyoruz. Burada hem ER+ hem de endokrin dirençli ve hassas meme kanserlerinin fonksiyonel bir RET tirozin kinaz sinyal yoluna sahip olduğunu gösterdik, ancak endokrin duyarlı meme kanseri hücrelerinin endokrin direncini sürdürebilmesi için gerekli RET ligandları bulunmuyor. Bir RET ligandının, GDNF’nin transkripsiyonu, ER+ MCF-7 hücre hattında direnç kazandırmak için gerekli ve yeterlidir. Endokrin dirençli hücreler tarafından üretilen endojen GDNF çevrilir, ortama salınır ve yakın hücrelerde RET sinyalini aktive eder. Hastalarda RET ligand ekspresyonu, endokrin tedavilere yanıt vermeyi öngörür ve sağkalım ile korelasyon gösterir. Toplu olarak, bizim bulgularımız ER+ tümör hücrelerinin RET aracılı endokrin direnci için “dengelenmiş” olduğunu ve RET sinyal yolunun tüm bileşenlerini ifade ettiğini, ancak endokrin duyarlı hücrelerin direnç fenotipini başlatmak için gerekli olan RET ligandlarının yüksek ekspresyonundan yoksun olduğunu göstermektedir.

GİRİŞ

Östrojen reseptörü alfa (ERα), tüm meme kanserlerinin% 75’inin en büyük sürücüsüdür. ER+ meme kanseri hastaları için mevcut tedaviler büyük ölçüde ERα sinyal yolunu bloke etmeyi amaçlamaktadır. Örneğin, tamoksifen, E2 / ERa etkileşimlerini rekabetçi bir şekilde inhibe ederek ERα fonksiyonunu bloke eder ve fulvestrant, ERa’nın ubikitin aracılı bozunmasını teşvik eder . Endokrin tedavilerin meme kanseri mortalitesini % 25-30 oranında azalttığı tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, endokrin tedavilerin yaygın başarısına rağmen, meme kanseri hastalarının yaklaşık % 40-50’si ya tanı sırasında endokrin-dirençli meme kanseri ile ya da tedavi sırasında endokrin-dirençli hastalığa dönüşeceklerdir. Dolayısıyla, endokrin direncin mekanizmasını daha da aydınlatmak için acil bir ihtiyaç vardır.

Çok sayıda çalışma, artık E2’den bağımsız hücre büyümesi ve sağkalımı için mekanizmalar sağlayabilen büyüme faktörü ile uyarılan sinyalleme “kaçış” yollarını tanımlamıştır. Bunlar arasında en önemlisi, RET tirozin kinaz sinyal yolağı, hem hücre kültürü modellerinde hem de birincil dokularda endokrin direnciyle ilişkili bulunmuştur. Bu çalışmalar, RET sinyallemesinin alt-hedeflerine dayanan etkili yeni biyobelirteçlere yol açmıştır. Bununla birlikte, RET sinyal yolunun direnci, bazı durumlarda aromataz inhibitörlü modellerde direnci yönlendirmek için fonksiyonel bir ERa’ya dayanarak karmaşık olduğunu kanıtlamıştır. Dahası, RET veya onun ko-reseptörü GFRA1’deki genetik değişiklikler klinik vakalarda yaygın görünmemektedir, bu da ek faktörlerin dahil olduğunu düşündürmektedir. RET aracılı sinyalleme yolaklarının transkripsiyonel hedeflerinin daha iyi anlaşılması ve bu yolakların ERα sinyallemesi ile nasıl karıştığının anlaşılması, yeni kestirimci biyobelirteçlerin ve terapötik müdahale için yeni hedeflerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Burada, tamoksifen duyarlı (TamS) ve dirençli (TamR) MCF-7 hücrelerinde RNA polimerazını kapsamlı bir şekilde haritalamak için Precision Run-On ve Sequencing (PRO-sekq) kullanıldı. Bu yaklaşım, uyaranlara derhal ve geçici transkripsiyonel yanıtlara karşı oldukça duyarlıdır ve hedef genlerin aktivasyon dakikaları içinde keşfine olanak tanır. Dahası, aktif transkripsiyonel düzenleyici elemanlar (TRE’ler), hem promotörler hem de distal arttırıcılar dahil olmak üzere, bu yöntemle tespit edilebilir, çünkü bu elemanlar, tanımlamalarına yardımcı olabilecek farklı transkripsiyon desenleri sergilerler. TamS ve TamR MCF-7 hücrelerinde farklılık gösteren 527 gen ve 1.452 TRE arasında, TamR MCF-7 hücrelerinde yukarı regüle edilecek olan RET tirosin kinaz reseptörünün bir ligandı olan glial hücre soyu türevi nörotrofik faktör (GDNF) tanımlanmıştır. Dikkat çekici bir şekilde, RET reseptör sinyallemesi yoluyla endokrin direncini sağlamak için gerekli olan tüm proteinlerin, tek bir sınırlayıcı protein, GDNF veya diğer RET ligandları (GDNF, NRTN, ARTN) haricinde TamS MCF-7 hücrelerinde eksprese edildiğini bulduk. veya PSPN). Bu modeli test etmek için, MCF-7 hücrelerinde GDNF ifadesini manipüle ettik ve MCF-7 hücre modelimizde yüksek GDNF ekspresyonunun hemoksijen direnci için hem gerekli hem de yeterli olduğunu bulduk. Bazı kanıtlar, RET ligandlarının, RET ve onun ko-reseptörlerinin yeterli ekspresyonu da dahil olmak üzere, klinik örneklerde sınırlayıcı bir reaktif olduğunu, ancak GDNF ve diğer RET ligandlarının primer tümörlerde ekspresyonunu sınırlandırdığını göstermektedir. Ek olarak, RET ligand ekspresyonu, meme kanseri hastalarında endokrin tedavilerine yanıt vermeyi öngörmektedir. Birlikte ele alındığında, çalışmalarımız, RET ve ko-reseptörü eksprese ederek, RET aracılı endokrin direnci için tamoksifen duyarlı ve dirençli hücrelerin “dengelendiği” bir modeli desteklemektedir, ancak dirençli bir fenotipi sürmek için RET ligandlarının bolluğu ile sınırlıdır.

SONUÇLAR

Endokrin duyarlı ve dirençli MCF-7 hücreleri arasındaki transkripsiyonel farklılıklar
MCF-7 hücreleri ER + ‘dır ve genellikle büyüme ve proliferasyon için E2 gerektirir, ancak heterojen MCF-7 hücre popülasyonunun bir alt grubu tamoksifen gibi anti-östrojenlerin varlığında büyümeye devam eder. Dirençli hücrelerin, tamoksifen direncinde nedensel bir rol oynayan faktörleri tanımlamak için kullanılabilecek eşsiz bir transkripsiyonel program sergilediğini varsaydık. PRO-sekq’i, RNA polimerazının iki tamoksifen duyarlı (TamS) ve klonal olarak MCF-7 hücrelerinden klonal olarak türetilmiş iki de novo dirençli (TamR) MCF-7 hücre hattında konum ve yönelimini haritalamak için kullandık. Gonzalez-Malerva çalışmasına uygun olarak, TamS çizgilerinin (TamS; B7TamS ve C11TamS) 1 nM tamoksifen kadar duyarlı olduğunu, TamR çizgilerinin (TamR; G11TamR ve H9TamR) yüksek konsantrasyonlarda etkilenmediğini bulduk. PRO-seq kütüphaneleri, daha önce tarif edildiği gibi  dört hücre hattından hazırlandı ve 87 milyon benzersiz eşlenmiş okumaya kombine edilmiş bir derinliğe dizildi. Açıklanan gen gövdelerinde Pol II bolluğunu karşılaştırarak MCF-7 hücre alt klonlarındaki transkripsiyonun benzerliğini nicelleştirdik. Tarafsız hiyerarşik kümelenme, bir kümeye B7TamS ve C11TamS TamS hatlarını  gruplandırdı ve G11TamR ve H9TamR TamR hatlarını  daha uzak bir şekilde dışsal gruplar olarak bıraktı. TamR hücreleri bağımsız olarak kümelenmiş olsa da, her dört MCF-7 klonu yine de oldukça yüksek oranda korelasyonludur (Spearman’ın Rho> 0.95), bu da tamoksifen direnç fenotipini üretmek için nispeten az transkripsiyonel değişimin gerekli olduğunu düşündürmektedir.

ER + meme kanseri hücreleri ve endokrin tedavisine duyarlı primer meme kanserleri, GDNF’yi direnç başlatmaktan yoksundur.
B7TamS MCF-7 hücrelerinde rekombinant GDNF’nin endokrin direnç için yeterli olduğunu gösteren bulgumuz, GDNF’nin, TamS hücrelerinin dirençli bir fenotip geliştirmesini engelleyen bir anahtar sınırlayıcı faktör olduğunu göstermektedir. Bu hipotezi primer meme kanserlerine genişletmek için, GDNF ekspresyonunun normalde düşük olup olmadığını, yani ER + meme kanserlerinin çoğunda RET yol aktivasyonunu sınırlayabileceğini saptamaya çalıştık. Gerçekten de, GDNF ekspresyonu TCGA (S3B İncir) ile analiz edilen 1,177 primer meme kanserinin sadece 565’inde (% 48) saptanabilirdi. Prensipte, RET sinyallemesi dört RET ligandından herhangi biri (GDNF, NRTN, ARTN ve PSPN) tarafından aktive edilebilir. Bununla birlikte, birincil meme tümörlerinde sadece düşük seviyelerde NRTN, ARTN veya ko-reseptörleri saptanmıştır. Bu nedenle, RET ligand ekspresyonunun, kısmen ERα tarafından aktive edilen hücre yüzeyi reseptörleri, özellikle RET ve GFRa1 ile karşılaştırıldığında düşük olduğu sonucuna vardık. RET reseptörleri ve ligandlar arasındaki bu karşıtlık, RET sinyal yolunun, reseptörlerin ekspresyonu yoluyla endokrin direnç için “dengelendiği” ve GDNF ekspresyonunun veya muhtemelen başka RET ligandlarının sınırlayıcı düzeylerinin, çoğu tümörde endokrin duyarlılık temin edeceği bir modeli desteklemektedir.

Daha sonra, ER + tümörlerinin bir alt grubunda yüksek RET ligand ekspresyonunun bazı endokrin direnç durumlarını açıklayıp açıklayamayacağını araştırdık. TCGA meme kanserlerinde GDNF ekspresyonu dağılımının dikkatli bir incelemesi, TCGA veri setindeki vakaların bir alt kümesinde yüksek GDNF ekspresyonunu gösteren uzun bir kuyruğu ortaya çıkardı. GDNF ifadesinin RET bağımlı endokrin direncini sınırladığı hipotezimiz, bu GDNF-yüksek örneklerinin endokrin direncine eğilimli olması gerektiğine işaret etmektedir. Ampirik olasılık yoğunluk fonksiyonunun simetrisine dayanarak GDNF’nin yüksek oranda ifade edildiği dereceyi ölçmek için, “sıra dışı puan” olarak adlandırdığımız basit, parametrik olmayan bir hesaplama yaklaşımı geliştirdik. Bu puana dayanarak, TCGA veri setindeki 925 ER + meme kanseri hastasının 122, RET ligandlarından en az birinin (% 13), 57’si GDNF’nin yüksek seviyesine sahip olduğu yüksek bir ekspresyona sahip olduğunu tahmin ediyoruz.

RET ligandları, burada önerdiğimiz gibi, endokrin direnç için sınırlayıcı faktör ise, bu uzun dağıtım kuyruğunda bulunan vakalar, endokrin tedavilere dirençli olma olasılığı daha yüksektir. Bu hipotezi test etmek için, aromataz inhibitörü letrozole yanıt veren veya yanıt vermeyen hastaların biyopsileri ile prospektif olarak toplanan ekspresyon mikrodizi verilerini analiz ettik. Dört RET ligandından elde edilen toplam puanların toplamından oluşan bir skor, letrozol tedavisine cevap vermeyen hastalarda anlamlı olarak daha yüksektir (p = 0.016, tek taraflı Wilcoxon rank toplam testi). Buna karşılık, yanıt veren veya letrozole cevap vermeyen hastalarda RET ekspresyonunda anlamlı bir fark yoktur. Bu sonuçlar, RET ligand ekspresyonunun, RET’in kendisi olmadığını, bu kohort grubundaki letrozole yanıttaki farklılıkları açıkladığını göstermektedir.

Avatar
1995 yılında doğdum. Aydın Anadolu Lisesi'nde Comenıus Proje çalışmalarında broşür ve tanıtım dergi çevirileri yaparak okul çalımalarına katkıda bulundum. Yine lise döneminde şiir okumaları ve tiyatro incelemelerinde gençlik merkezi adı altında toplanan özel bir klüpte yürütücülük yaptım. 2014 yılında Bilecik Şeyh Edebali üniversitesi Moleküler Biyooji ve Genetik bölümünü kazandım. Bölümümüzün klübü olan GENE-CELL de 2014-2015 yılında çevirmen- yazarlık 2016-2017 yılında ise editörlük yaptım. Şu an TUBITAK Projesiyle kanser çalışmalarında proje yürütmekteyim. Moleküler Biyoloji ve birçok alt dallarda makale yazmaya ve çevirmenliğe devam ediyorum. Ve biriktirdiğim edebi yahut bilimsel çalışmalarımı Mornota da sizlerle paylaşıyorum. Okumaktan ve yazmaktan geri kalmayın dostlar. Sizi en iyi kelimeler ve kitaplar anlar.

Kimler Neler Demiş?

Please Login to comment